荧光定量PCR引物设计原则

1、引物长度一般在15-30bp

引物长度一般为15-30bp，常用的为18-27bp，但不应大于38bp，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应；

2、引物GC含量一般为40%-60%

引物GC含量一般为40%-60%，以45-55%为宜，GC含量过高或过低都不利于引发反应。上下游引物GC含量和Tm值要保持接近；

3、引物所对应的模板序列的Tm值好在72℃左右

Tm值在72℃左右可使复性条件佳，至少要在55-80℃之间。Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo软件中使用的是邻近法(the nearest neighbor method)；

4、引物3’端的碱基一般不用A

引物3’端的碱基一般不用A，因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高。

5、引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加。

6、引物3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。

7、如扩增编码区域，引物3’端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第三位易发生简并，会影响扩增特异性与效率；

8、引物5’端可以修饰

引物5’端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。

9、碱基要随机分布，且引物自身和引物之间不能有连续4个碱基的互补。

引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续4个碱基的互补。两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3’端的互补重叠以防止引物二聚体（Dimer与Cross Dimer）的形成。引物之间不能有连续4个碱基的互补。引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其△G值不要过高（应小于4.5kcal/mol）。否则易导致引物二聚体带的 产生，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。

10、引物的ΔG值好呈正弦曲线形状，即3’端ΔG值较低，而5’端和中间ΔG值相对较高。

ΔG值（自由能）反应了引物与模板结合的强弱程度，一般情况下，引物的ΔG值好呈正弦曲线形状，即3’端ΔG值较低，而5’端和中间ΔG值相对较高。3'端的ΔG值相对要低，且绝 对值不要超过9，引物的3’端的ΔG值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。

11、引物应在核酸保守区内设计并具有特异性。引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。